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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410355436.2 (22)申请日 2014.07.24 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104152444 A (43)申请公布日 2014.11.19 (73)专利权人 中国科学院海洋研究所 地址 266071 山东省青岛市南海路7号 (72)发明人 佘智彩李莉张国范 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 21002 代理人 周秀梅刘阳 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01。
2、) 审查员 高巍 (54)发明名称 一种与长牡蛎糖原含量性状相关的SNP标记 及其应用 (57)摘要 本发明涉及一种与长牡蛎糖原含量性状相 关的SNP标记及其应用。 SNP标记位点命名为 TY202， 位于糖原脱支酶基因的第3个外显子上， 基因型为Y。 所述TY202位于糖原脱支酶基因的5 端第7022碱基处。 第3个外显子位于糖原脱支酶 基因的5 端6446-7043碱基对处。 SNP标记位点基 因型为T/T或T/C的个体糖原含量高于基因型为 C/C的个体。 本发明用检测个体基因型的方法可 以预测个体糖原含量的高低， 育种中可用于选择 目标个体， 用于分子标记辅助选择育种。 避免了 糖原检测。
3、过程中浓酸浓碱的使用， 使操作更加安 全简便。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图1页 CN 104152444 B 2017.09.29 CN 104152444 B 1.一种与长牡蛎糖原含量相关的SNP标记特异性引物对在糖原含量检测中的应用， 所 述特异性引物对序列为： F： 5 -TAGTAAAGACAGGCAGCA-3 ； R： 5 -TCATTTGTAGACAGGGAG-3 ； 所述SNP标记位于糖原脱支酶基因的第3个外显子上， 基因型为Y。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104152444 B 2 一种与长牡蛎糖原含量性状相关的SNP标记及其应用 技术领域 0001 。
4、本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域， 具体地说是一种与长牡蛎糖原含量 性状相关的SNP标记。 背景技术 0002 长牡蛎， 属软体动物门中的瓣鳃纲(或双壳纲)， 肉质肥嫩， 营养丰富， 糖原是牡蛎 中一种重要的风味营养物质， 可直接被机体吸收， 从而减轻胰腺负担， 因此对糖尿病的防治 十分有效。 0003 糖原脱支酶是牡蛎糖原降解过程中的一种酶， 其作用主要是水解 -1,6糖苷键， 移 去糖原的分支， 使支链糖原变为直链糖原。 人糖原脱支酶缺乏可引起糖原累积症一111型疾 病。 目前已有糖原脱支酶的DNA全长， 国内外对其进行了突变筛查并发现多处突变位点， 但 并未发现公认的突变热点。 0。
5、004 SNP即单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism)， 主要是指在基因组 水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列的多态性。 SNP分布广， 密度高， 具有高度的遗 传稳定性。 与其他种类的分子标记相比， SNP标记能够更好地反应生物基因组内的序列信 息， 可以更详细地研究基因组内序列多态性与表型性状之间的关联， 有效地指导基因鉴定 和定位的工作。 0005 水产动物育种研究起步晚， 主要集中于对生长性状的研究， 方法大多采用传统的 选择， 杂交， 周期长， 见效慢。 对长牡蛎的品质性状研究还不多见。 近年来， 随着基因组学研 究取得一系列突破， 分。
6、子标记辅助选择等分子育种技术日渐成熟， 大大提高了遗传育种水 平。 利用分子标记辅助选择可以减少盲目性， 缩短育种年限， 提高育种的效率。 关联分析是 近些年发展起来的鉴定与目标性状关联的分子标记和基因的热门方法。 关联分析， 又称连 锁不平衡作图(LD mapping)或关联作图(Association Mapping)， 是一种以连锁不平衡为 基础， 鉴定某一群体内目标性状与遗传标记或候选基因关系的分析方法。 关联分析能够检 测特定群体的所有重组和变异事件， 具有较强的精度。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种与长牡蛎糖原含量相关的SNP标记， 为长牡蛎的分子标 记辅助选择提供参考。
7、。 0007 为实现上述目的本发明的技术方案为一种与长牡蛎糖原含量相关的SNP标记， 它 位于糖原脱支酶基因的第3个外显子上， 基因型为Y。 得到SNP位点TY202， 位于糖原脱支酶基 因的5 端6446-7043碱基对处的第3个外显子上。 所述TY202位于糖原脱支酶基因的5 端第 7022碱基处。 0008 其 特 异 性 引 物 序 列 为 ： F ： 5- T A G T A A A G A C A G G C A G C A - 3； R ： 5- TCATTTGTAGACAGGGAG-3 ； 引物扩增片段长度为75bp， 扩增核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。 0009 基。
8、因型为T/T、 T/C或C/C， 在该位点基因型为T/T或T/C的个体糖原含量高于基因型 说明书 1/6 页 3 CN 104152444 B 3 为C/C的个体。 0010 在野生群体中检测各个个体的基因型和表型数据， 由基因型和表型数据通过关联 分析预测得出TY202和长牡蛎糖原含量的性状相关度达到显著水平(P0.05)， 与长牡蛎糖 原含量的性状关联， 可用于长牡蛎的标记辅助选择育种。 0011 与长牡蛎糖原含量性状相关的SNP标记的检测方法， 其筛选步骤是： 0012 a)采集青岛胶南的野生长牡蛎群体中多个个体， 对其进行解剖， 分组织(闭壳肌、 鳃组织等)取样， 用液氮速冻后于-80。
9、保存， 做为实验材料； 0013 b)测定每个个体闭壳肌中的糖原含量， 得到表型数据； 0014 c)用酚-氯仿抽提法提取每个个体鳃的总DNA； 0015 d)选定长牡蛎糖原代谢相关基因作为候选基因， 根据长牡蛎转录组数据预测的 SNP位点设计引物， 筛选引物后利用HRM方法针对每一个SNP检测个体基因型； 0016 e)利用GAPIT软件进行关联分析， 预测与长牡蛎糖原含量性状相关的SNP位点。 0017 本发明的优点： 0018 本发明用检测个体基因型的方法可以预测个体糖原含量的高低， 育种中可用于选 择目标个体， 用于分子标记辅助选择育种。 避免了糖原检测过程中浓酸浓碱的使用， 使操作 。
10、更加安全简便。 附图说明： 0019 图1是引物筛选结果。 其中， 泳道5为Marker， 所用Marker为Marker1。 泳道10-13为 SNP位点TY202引物筛选结果。 0020 图2是SNP位点TY202 HRM验证结果。 0021 图3是SNP位点TY202群体分型结果。 具体实施方式 0022 以下实施例将对本发明作进一步的阐述， 实施例仅用于说明本发明， 本发明不限 于此。 本发明所采用实验用品均来自市购。 0023 序列表(1)SEQ ID NO.1的信息 0024 序列特征长度： 75bp 0025 类型： 核酸 0026 链型： 双链 0027 拓扑结构： 线形 00。
11、28 分子类型： DNA 0029 来源： 长牡蛎 0030 序列描述： 0031 TAGTAAAGACAGGCAGCATGCTGAYGGTGAAGGGTACTTTTTGGTGGACCCCATCCTCTCCCTGTCTAC AAATGA 0032 实施例1 0033 与糖原含量相关的SNP位点的筛选 0034 a)样品的采集： 采集青岛胶南的野生长牡蛎群体中多个个体， 共144只， 对其进行 说明书 2/6 页 4 CN 104152444 B 4 解剖， 分组织(闭壳肌、 鳃组织等)取样， 用液氮速冻后于-80保存备用。 0035 b)糖原含量检测： 用南京建成生物工程研究所的肌糖原及肝糖原。
12、测定试剂盒检测 每个个体闭壳肌中的糖原相对含量， 检测方法按照说明书中的操作步骤进行。 0036 1)取样： 取冻存的肌肉样品用生理盐水漂洗后， 滤纸吸干， 称重(样本重量 100mg)。 0037 2)水解： 按样本重量(mg)： 试剂盒中碱液体积( l)1:3， 一起加入试管中， 沸水浴 煮20min， 流水冷却， 得到糖原水解液。 0038 3)制备糖原检测液： 将糖原水解液加蒸馏水稀释即得到糖原检测液， 加蒸馏水的 量为( l)： 样本重量(mg)*16。 0039 操作表如表1所示。 0040 表1 0041 空白管标准管测定管 蒸馏水(ml)1.00.9 0042 0.01mg/m。
13、l标准(ml)1.0 糖原检测液(ml)0.1 显色液(ml)222 0043 标准溶液和显色液均采用试剂盒中自带溶液。 0044 混匀后置沸水中煮5min， 冷却后于620nm波长， 1cm光径下， 用空白管调零， 测各管 OD值。 0045 计算公式如下： 0046 0047 c)DNA提取： 用酚-氯仿抽提法提取每个个体鳃的总DNA。 0048 1)取1.5 ml离心管， 加入700 l DNA提取缓冲液(100 mM Tris-HCl， 5 mM EDTA)， 取3-10mg的牡蛎鳃组织， 用剪刀剪碎。 所用器皿在两个个体之间必须用火焰灭菌和ddH2O冲 洗以防个体间的交叉污染。 加入。
14、35 lSDS， 混匀。 加入2 l蛋白酶K， 混匀。 0049 2)将离心管在65金属浴中孵育， 1.5小时后每管补加2 l蛋白酶K， 期间轻轻摇动 离心管组织完全消化后继续孵育半小时以上， 总孵育时间至少3小时。 0050 3)将孵育后的样品冷却至室温， 加入等体积的PCI， 充分混匀， 13000rpm离心10 min。 重复上述步骤一次。 PCI为酚： 氯仿： 异戊醇(25:24:1)的混合溶液。 0051 4)将步骤3)的上清液再用氯仿： 异戊醇(24:1)抽提1次， 13000 rpm离心5 min。 0052 5)将步骤4)的上清液移入等体积-20异丙醇， 来回颠倒充分混匀， -。
15、20放置 20min。 0053 6)将步骤5)的混合液在4， 13000 rpm离心5 min。 小心倒出所有液体， 注意不要 让底部的白色沉淀颗粒移动或倒出。 0054 7)用-2075乙醇洗涤2次倒出液体， 开口放置离心管晾干乙醇， 0055 待白色沉淀变为无色透明时加入50-100 l(具体看DNA的量)ddH2O来溶解DNA。 置 说明书 3/6 页 5 CN 104152444 B 5 于-20备用。 0056 d)引物设计： 依据长牡蛎转录组数据预测出的SNP位点， 利用Primerpremier 5软 件进行引物设计， 扩增产物大小控制在50-100bp， 本实验最终引物序列为。
16、： F： 5 - TAGTAAAGACAGGCAGCA-3 ； R： 5 - 0057 TCATTTGTAGACAGGGAG-3 。 引物扩增片段长度为75bp， 扩增核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。 0058 e)引物筛选： 从实验群体中随机挑取4个个体的DNA做为模板进行PCR扩增， PCR反 应采用10 l体系， 以15 l矿物油封口， 反应条件如表2所示。 0059 表2 0060 0061 扩增产物用10的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行检测， 在电压200V下电泳20min。 紫 外凝胶成像仪下观察结果(图1)。 电泳条带清晰单一且在4个模板中一致， 表明该引物特异 性好且扩增效率。
17、高， 可用于下一步实验； f)HRM法验证SNP位点： 0062 1)从实验群体中随机挑取8个个体的DNA做为模板， 用筛选出的引物重新进行PCR 扩增， 扩增反应在带裙边的96孔PCR反应板里进行， PCR反应采用10 l体系， 以15 l矿物油封 口， 反应条件如表2所示。 0063 2)反应结束后加入1 l内标和1 l LC-green染料， 瞬时离心后95变性10min， 冷 却至室温。 0064 内标为退火温度稳定的短核苷酸序列， 长50bp， 由高温内标和低温内标等体积混 合而成。 0065 3)取出96孔PCR反应板放入LightScanner 96机器进行HRM检测， 收集55。
18、-95之 间的荧光信号， 运行完毕根据熔解曲线进行结果分析(图2)， 熔解曲线整齐的位点为验证出 的SNP位点。 0066 g)HRM法检测个体基因型： 用筛选出的合格引物对实验群体中的144个体进行PCR 扩增， 得出每个个体的熔解曲线(图3)。 具体操作方法同上。 0067 h)关联分析： 将表型数据和基因型数据导入GAPIT软件， 运行软件进行关联分析。 得到全基因组预测的结果， 根据全基因组预测结果筛选出与长牡蛎糖原含量性状相关的 SNP位点TY202(P0.008)， 在SEQ ID NO.1中自5 末段起第25个核苷酸。 0068 统计每个个体的糖原含量得出144个个体的糖原含量的。
19、平均值， 在基因型为T/T的 说明书 4/6 页 6 CN 104152444 B 6 个体糖原含量平均为5.48mg/g， 基因型为T/C的个体糖原含量平均为5.59mg/g。 基因型为C/ C的个体糖原含量平均为4.12mg/g。 所以， 在该位点基因型为T/T或T/C的个体糖原含量高于 基因型为C/C的个体。 0069 实施例2 0070 一种与长牡蛎糖原含量相关的SNP标记的应用 0071 a)样品的采集： 采集青岛神汤沟的野生长牡蛎群体共96只， 对其进行解剖， 取鳃和 闭壳肌， 用液氮速冻后于-80保存备用。 0072 b)DNA的提取： 提取方法同实施例一中的c)。 0073 c。
20、)SNP位点TY202基因型检测： 0074 1)以神汤沟的96只野生长牡蛎DNA为模板， 用TY202的特异性引物进行PCR扩增， 扩 增反应在带裙边的96孔PCR反应板里进行， PCR反应采用10 l体系， 以15 l矿物油封口， 反应 条件如表2所示。 0075 2)反应结束后加入1 l内标(内标同上)和1 l LC-green染料， 瞬时离心后95变 性10min， 冷却至室温。 0076 3)取出96孔PCR反应板放入LightScanner 96机器进行HRM检测， 收集55-95之 间的荧光信号， 运行完毕根据熔解曲线进行结果分析， 统计每个个体的基因型。 0077 检测后， 仅。
21、有第40组的基因型为C/C， 其他均为基因型为T/T或基因型为T/C， 根据 实施例1的结论进行预测判断， 第40组个体的糖原含量低于其他各组含量， 再进行糖原含量 的检测。 0078 d)糖原含量的检测： 检测方法同实施例一中的d)。 0079 表3数据显示， 在SNP位点TY202基因型为T/T的个体糖原含量平均为6.11mg/g， 基 因型为T/C的个体糖原含量平均为6.76mg/g， 基因型为C/C的个体糖原含量为2.50mg/g。 以 上结果证明， 基因型为T/T或T/C的个体糖原平均含量高于基因型为C/C的个体。 0080 经检测， 我们的预测结果正确， 第40组个体的糖原含量低于。
22、其他各组含量。 0081 综上所述， SNP位点TY202与糖原含量是关联的， 通过检测SNP位点TY202的基因型， 可以预测出个体的糖原含量的高低。 0082 表3 0083 个体编号糖原含量基因型个体编号糖原含量基因型个体编号糖原含量基因型 18.43TT332.19TC655.89TT 25.98TT343.93TT668.35TC 37.84TC356.36TT675.53TT 44.50TT365.23TT686.42TT 56.58TT374.58TT698.99TC 62.85TT385.55TT709.71TT 77.13TT395.46TC718.05TC 88.44TT4。
23、02.50CC726.75TT 99.17TT414.31TT735.34TC 106.53TT426.40TT744.50TT 113.45TT438.04TT755.66TT 126.08TT444.95TT764.43TT 136.29TT455.53TT779.15TT 说明书 5/6 页 7 CN 104152444 B 7 146.85TT467.80TT786.79TT 154.25TT477.63TC798.06TT 168.19TT486.38TT805.08TT 173.44TT496.19TT815.70TT 183.47TT505.79TT827.62TT 195.58。
24、TT516.90TT836.59TT 205.99TT528.10TT845.89TT 217.07TC537.55TT853.42TC 227.84TT543.48TT8610.20TT 235.20TT554.50TT876.01TT 244.00TC563.95TT889.12TT 256.15TT574.23TT897.80TT 264.05TT585.17TT908.66TC 275.17TC595.91TT914.85TT 285.25TT603.90TT925.31TT 297.15TT616.91TT935.75TT 302.19TT625.76TT945.65TT 317.37TT6310.11TC954.78TT 325.37TT649.79TT966.20TT 0084 注： 糖原含量单位为mg/g。 说明书 6/6 页 8 CN 104152444 B 8 0001 0002 序列表 1/2 页 9 CN 104152444 B 9 0003 0004 0005 序列表 2/2 页 10 CN 104152444 B 10 图1 图2 图3 说明书附图 1/1 页 11 CN 104152444 B 11 。
